尽管彼得·达尔伯格是个修补匠，但他在过去几年里拆毁价值150万美元的显微镜并不是为了好玩。相反，美国能源部SLAC国家加速器实验室的科学家兼2021年潘诺夫斯基研究员Dahlberg和他的同事们的目标是改进一些世界上最强大的显微镜，以详细地可视化细胞内部发生的情况。
作为斯坦福大学的博士后研究员，达尔伯格与WEMoerner和WahChiu一起工作，WEMoerner因开发超分辨率荧光显微镜而获得2014年诺贝尔化学奖，而WahChiu是低温电子显微镜(cryo-EM)及其相关技术的先驱。表弟低温电子断层扫描(cryo-ET)。
超分辨率荧光显微镜非常适合追踪单个分子，例如细胞中的蛋白质，但无法揭示附近发生的其他情况。另一方面，冷冻电子断层扫描可以产生非常高分辨率的细胞图像，但无法精确定位单个分子或它们的作用，因此达尔伯格将这两种技术合二为一。
“我们的目标是保持两全其美，”达尔伯格说。“你保留了荧光显微镜的分子特异性，所以你知道谁是谁，然后你可以将其置于冷冻电子断层扫描的这些高分辨率结构的背景中。”
完善这项技术的每一项进步都让科学家们更加了解驱动细胞分裂或寄生宿主入侵等分子机器。但结合技术需要对非常昂贵的设备进行大量修改，达尔伯格说“这既有趣又令人伤脑筋”。
第一步：拆开显微镜。
两种方法，一种显微镜
在荧光显微镜中，研究人员用一个较小的分子标记单个分子，例如蛋白质，当研究人员用光照射它时，该分子会发光。然后，他们可以在普通(如果分辨率非常高)光学显微镜下追踪细胞内感兴趣的单一蛋白质的确切位置。
问题是，你无法看到蛋白质附近还有什么或者细胞中发生了什么。它缺乏上下文。
另一方面，低温电子断层扫描使用电子显微镜来研究速冻样品，例如细胞。尽管该技术可以生成极高分辨率的细胞图像，但不可能精确定位感兴趣的单个蛋白质或分子。它缺乏特异性。
典型的电子显微镜-关联照片。
典型的电子显微镜——关联照片。图片来源：NCI
在他的工作中，达尔伯格将这两种技术合二为一，恰当地命名为“超分辨低温相关光和电子断层扫描”。他将分别执行这两种技术，然后叠加生成的图像，以获得目标分子及其周围环境的清晰视图。
但在这个过程的一开始就出现了一个问题。达尔伯格必须将含有荧光标记蛋白质的细胞滴到冷冻电子发射网格(直径仅为3毫米的圆形金属网)上，然后快速冷冻它们，使网格上的水玻璃化或变成玻璃。一旦微小的网格被冻结，它就必须保持冻结状态并且不受污染。移动的次数越少越好。
第二个问题是，这些冷冻细胞有数千纳米厚，但用于冷冻电子断层扫描的电子穿透深度不能超过200纳米。
为了解决这些问题，达尔伯格一直在优化一种名为“带有扫描电子显微镜的聚焦离子束铣削系统”或FIB-SEM的设备。
聚焦离子束切除细胞材料，留下冷冻细胞的极薄切片，冷冻电子断层扫描电子可以穿透。然后扫描电子显微镜向样品发射电子并产生精美的高分辨率冷冻电子断层扫描图像。
但FIB-SEM没有附加光学显微镜，这意味着Dahlberg必须移动网格才能获取荧光显微镜数据，因此Dahlberg拆掉了FIB-SEM并添加了一个光学显微镜。
“本质上，我们只是拆解了这个价值150万美元的精密仪器来安装这个集成光学显微镜，”他说，“现在我们有了一个更好的系统。”
修改即将完成，团队渴望充分利用它。“我认为我们现在确实正处于在FIB-SEM中实现超分辨率的边缘，”他说。但团队并没有只是坐等显微镜完成。
修补技术
2020年，达尔伯格使用相关技术追踪新月柄杆菌细菌细胞内的蛋白质。
C.Crescentus很有趣，因为它不是对称分裂产生两个相同的子细胞，而是不对称分裂-它产生一个移动细胞和一个静止细胞。生物学家对这种机制很感兴趣，因为它可以揭示大多数人类细胞中发生的类似但更复杂的过程。
达尔伯格认为这是测试他的技术的一个很好的系统。
Dahlberg和他的团队使用他们的技术追踪了两种蛋白质，即SpmX和PopZ，这准确地显示了不对称细胞分裂过程中SpmX和PopZ在细胞中的位置。这为了解它们如何相互作用以在细菌生命周期中发挥各自的作用提供了线索。也许更重要的是，实验证明相关技术是可行的。
但它并不完美。“荧光真的很糟糕，”达尔伯格说。“原因之一是我们必须将激发光保持在非常低的水平。当我们用光照射样品时，样品就会升温。”
他意识到冷冻电子断层网的构成材料会吸收光线并破坏冷冻样本。他想改用具有不同热学和光学特性的材料——银——但没有人制造或销售银网格。
几个月后，达尔伯格来到了SLAC。他周围都是机械车间和工程师，他们几乎可以制造出SLAC科学家梦想的任何东西。所以他干脆设计了更好的网格。
但他并没有就此止步。接下来，他和WEMoerner实验室的研究生DavisPerez领导的斯坦福大学团队为光学显微镜设计了一个更好的平台。现在，他正在设计不同种类的荧光标记——生物传感器——以在低温条件下工作。
生物传感器是荧光分子，会根据当地环境改变其发射或激发特性，因此它们会在一种环境中发出一种颜色，但在另一种环境中发出不同的颜色。“它们可以被调整为对pH值、钙离子敏感——凡是你能想到的，”达尔伯格说。
“它们可以调节数百个环境变量。那么，除了具体位置和高分辨率的结构信息之外，你还可以知道，我的细胞是健康还是患病?即将进行分裂?在高ATP浓度下?它提供了所有这些额外的背景信息。”
达尔伯格决心继续改进这些工具，一次一个地克服技术障碍，直到该技术得到优化并充分发挥其潜力。
除了技术挑战之外，达尔伯格还应对了从博士后过渡到首席研究员生活的专业挑战。
“在博士后结束时，你处于研究能力的顶峰，你已经接受了十多年的培训，你拥有出色的实验双手，你已经准备好承担一切，”他说，“但是你不可能自己同时做20个实验并且让它们全部起作用。”所以他正在组建一支摇滚明星团队来提供帮助。
2022年，达尔伯格只有一名员工——暑期实习生。到今年秋天，他将拥有10个。
球队解决了人手不足的问题，但也拉走了达尔伯格的替补席。这很艰难。“大部分工作不再直接与科学有关，”他说。“我每天都在思考办公空间、招聘、撰写赠款、采购问题以及为人们提供资金。”
但这是值得的。达尔伯格说，看着他精心策划的团队带着想法运转是令人兴奋的。“他们做了你想都想不到的出色事情。然后你走进办公室，听到“哦，我有这个很酷的想法”和“我得到了这个令人兴奋的结果”。你为那些时刻而活。”
